L'ariosa e luminosa navata della Collegiata di S. Giovanni Battista è scandita dalle nicchie che contengono gli altari laterali e dalle paraste con capitelli dorici. Questi sostengono la trabeazione, al di sopra della quale si aprono le finestre e si imposta la volta.

L'interno ospita opere pregevoli come: una Madonna col Bambino, S. Gerolamo, Clemente I martire, S. Antonio abate del cantaniese Flaminio Allegrini, l'Annunciazione di Francesco Allegrini, una Madonna con Bambino, S. Martino, S. Antonio da Padova e S. Francesco Saverio di pittore della scuola marchigiana tardo – manierista.
Di notevole interesse sono inoltre La decollazione del Battista di Francesco Allegrini e l'altare di legno dorato con stemma roveresco, dono del duca Francesco Maria II della Rovere, in cui il dipinto è inserito.

A sinistra dell'altare maggiore si trova la cappella della Madonna della Misericordia dove è collocata la tela della Madonna della Misericordia, opera di Gaetano Lapis (1706 – 1776). Il dipinto è oggetto di una profonda devozione che ha origine dal 1737.

Pregevole il tondo in cornice dorata raffigurante la Vergine con il Bambino e S. Giovannino, detta la "Madonna del cardellino", opera attribuita al Perugino.

Nell'abside dietro l'altare maggiore è presente un coro in legno di noce intagliato, opera di maestranze locali risalente ai primi anni del Settecento. Il coro è formato da 21 stalli nel primo ordine e da panche nel secondo; gli stalli presentano nella parte superiore degli appoggiatoi a mensola decorati con motivi animaleschi e vegetali.
Nella parte centrale, in alto, si trova una gloria di legno scolpita a decorazione e sostegno della miracolosa immagine di Cristo legato alla colonna, di autore ignoto (sec. XVI). Ai lati della elaborata ornamentazione lignea vi sono le statue di S. Giovanni Battista e S. Cantiano, anche esse in legno. Il lavoro fu eseguito nel 1705 dall'intagliatore Antonio Montini da Siena ed indorato dai pergolesi Giuseppe Ferri e Franco Fabi nel 1706-1707.

Di buona fattura è il Crocefisso ligneo databile tra il XVI e il XVII secolo nel transetto sinistro.

Nel transetto destro degno di nota sono l'altare barocco in legno dorato che ospita la tela raffigurante l'Ultima Cena del cantianese Ventura Mazza (1560 – post 1633), allievo del Barocci, e la tela proveniente dalla chiesa di S. Agostino raffigurante la Madonna della neve col Bambino, S. Rocco e S. Francesco di Paola, probabilmente della scuola del De Magistris.

Sono da segnalare inoltre: una Madonna con Bambino e S. Francesco (metà del Settecento), di impronta marattesca; la Madonna con Bambino, S. Lucia, S. Filippo Neri e angeli alati del pittore Stefano Paragini (sec. XVII); la tela raffigurante la Nascita della Madonna di Francesco Allegrini (sec. XVII), e la Traslazione della Santa Casa di Loreto con angeli e S. Andrea apostolo attribuita alla scuola di Claudio Ridolfi (questo stesso soggetto è presente nel Duomo di Urbino).